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식품분석/BIO & 식품 관련

프로테오믹스(Proteomics)의 연구 방향과 국내 프로테오믹스 연구의 활성화

등록 2006.08.08 
프로테오믹스(Proteomics)의 연구 방향과 국내 프로테오믹스 연구의 활성화
 
백융기 교수
연세대 프로테옴연구센터장 (생명과학연구원)
 

1. 서론

오는 2000년 5월경이면, 인간의 게놈구조가 완전히 밝혀 짐에 따라 인간유전자의 기능을 본격적으로 연구할 수 있는 이른바 포스트게놈시대가 개화된다. 현재 18종 생물체의 게놈구조가 완전히 해독되었고, 최소한 30종 이상의 생물체 게놈이 2-3년내에 해독될 전망이다.

그러나 아무리 염기서열을 밝혀 낸다 한들 이들의 기능을 모른다면 큰 의미가 없다. 이렇게 유전자의 기능을 밝히는 총체적인 연구분야를 "Functional Genomics" (이하 유전체기능분석학) 라고 정의 하며, 여기에는 기술적으로 DNA 나 RNA를 시료로 사용하여 수행하는 지노믹스(Genomics: 이하 유전체학), 단백질을 대상으로 연구하여 유전자기능을 연구 하는 프로테오믹스(Proteomics: 단백질체학-편의상 이하 프로테오믹스라고 칭한다), 그리고 이 두분야를 지원하는 바이오인포매틱스(Bioinformatics: 이하 생물정보학)로 각각 구분 된다.

본 총설에서는 국내 연구수준에 비추어 세계적으로 충분히 경쟁성이 있고 따라서 국내의 연구활성화가 요구되는 프로테오믹스분야에 대하여 최근의 자료들을 분석하여 그 요지만을 소개 하고자 한다. 보다 상세한 자료를 원하는 연구자는 나열한 관련 문헌을 참고하면 될 것이다.

마침, 과기부가 주도하는 21C 프론티어사업에서도 이 분야의 연구를 수행 할 수 있도록 추진중에 있어서 국내연구자들에게는 본 총설이 프로테오믹스의 개념이해와 연구활성화에 유익한 참고자료가 되길 희망한다.

2. 프로테옴 (proteome)과 프로테오믹스(Proteomics) 그리고 유전체기능분석학 (Functional Genomics)

1) 정의

프로테옴(proteome) 이란 말은 어원적으로 단백질체 (protein-body (-some) 라고 풀이 할 수 있으나, 실제로는 게놈(Genome)의 상대어로서 <PROTEin expressed by a genOME>의 합성어로 인식되고 있는 말 이다 (Williams K. & Hochstrasser DF, 1997). 이 말은 1995년에 이태리 Siena에서 열린 2-D Electrophoresis meeting에서 처음으로 Marc Wilkins 에 의해서 사용된 것으로 지금은 보편화되었다. 프로테오믹스는 프로테옴(proteome)의 어미에 ∼학, ∼론을 의미하는 접미사 -ics 가 붙어 프로테옴을 연구하는 방법과 technique을 포괄적으로 의미하는 말로, 굳이 번역한다면 '프로테옴분석학' 이라고 해야 할 것이다. 즉, 단백질의 성질을 발현, post-translational modification, 다른 단백질과의 결합에 초점을 두어 연구하여 세포내 변형과정과 네트웍 형성을 질병의 진행과정과 연계시켜 총괄적으로 이해 할 수 있는 연구분야를 뜻한다.

2) 프로테오믹스와 유전체기능분석학(Functional Genomics)

90년대 까지만 하더라도 세포기능연구에 대한 분자생물학적인 접근은 대부분 단일 유전자나 그 유전자가 발현하는 mRNA의 발현조절을 중심으로 이루어진 반면에, 최근에는 유전체나 단백질체 중심으로 이른바 총체적생물학 (Hollistic Biology)의 개념으로 바뀌고 있는 추세이다. 이러한 추세를 반영하듯 " Functional Genomics-유전체기능분석학" 이란 말은 이제 익숙한 학술어가 되었다.

유전체기능분석학(Functional genomics)의 핵심은 개별 유전자의 기능을 다원적으로 시스템을 의미하는 것 같다. 가령, Genomics 에서는 DNA 수준에서 주로 유전자의 발현양상을 분석하는 것으로, EST (Expressed Sequence Tag)를 대량으로 chip에 붙이거나 하여 특정 질환이나 상태, 또는 조직이나 species의 표적 유전자가 어떻게 발현하는지를 조사한다 (DNA microarray technology). 프로테오믹스에서는 특정 유전자의 단백질 발현양상과 상호 결합 등을 먼저 규명하여 이 유전자의 정체를 규명하는 것으로 순서적으로는 genomics 와 대별되나 궁극적인 목표는 같은 것이다.

이 밖에도 genomics 의 한 분야로서, 인간의 유전적 다양성에 기반을 두고 SNP (Single Nucleotide Polymorphysm)를 분석하여, 이것으로 인한 약리작용의 차이를 규명하는 것으로 약리유전체학(pharmacogenomics)이 있으며, 이런 연구를 통해 각 개인별 약물 감응성이나 치료방법을 제공할 수 있다. 미국이나 유럽 등 다인종 지역에서는 이러한 연구가 매우 중요하며 일본도 이에 착수한 것으로 보고되고 있다. 가장 활발하게 연구하는 대상으로는 약리대사 단백질인 ' Cytochrome P450' 의 유전자가 대표적일 것이다.

3. 유전체학 (Genomics) 의 문제점

1) 유전체학의 문제

유전체학 (Genomics)은 세포의 DNA, RNA와 관련된 유사한 많은 기술을 내포하는 용어로서, 최근에는 유전정보의 수집, 체계적 분석, 발굴(mining)을 수행하는 연구분야를 포괄적으로 의미하기도 한다. 구조유전체학 (sturctural genomics) 분야는 유전자 정보로부터 기능을 예측하고, 구조와 기능간의 관계를 유추하여 이들의 3-D 구조를 규명한다. 이러한 결과를 사용하여 Drug ligand나 receptor의 공간적 관계를 추정할 수 있으며, 이를 drug design에 응용할 수 있다. 이 분야의 주된 연구체계는 염색체 지도와 유전자의 비교지도 작성, 그리고, DNA 구조결정, 그리고 부분적인 Bioinformatics로 구성되어 있다.

그러나 문제는 유전체학의 핵심연구대상인 인간 유전체 염기서열이 다 밝혀졌다고 해도, 염기서열만 가지고는 이 유전자 산물의 기능을 알 도리가 없다. 이것이 전사(transcription)되어 단백질 생성(translation) 수준에서 조절된다 하더라도 최종적으로 세포 내에서의 기능여부는 얼마나 정교하게, 적절하게 단백질합성후 변형(post-treanslational modification) 되는 가에 달려 있어서, 최종적으로 완벽한 모양이 갖추어진 단백질을 분석하지 않고는 그 유전자의 세포내 기능을 알 방법이 없는 것이다.

특히, 한 유전자의 mRNA가 만드는 단백질의 실제 기능적인 모습은 세포, 조직, 시간, 조절자에 따라 천태만상으로 변하기 때문에 (예, 1 mRNA가 1,000가지의 단백질을 지령한다는 설도 있다.) 이것을 생리적 변화에 따라 분석하는 tool과 system이 필요하다. 이것이 바로 프로테오믹스이다.

이와 유사한 방식으로 유전자와 단백질간에 유전자 기능연구의 일환인 전사(transcription) 조절체를 연구하는 system을 'transcriptomics', 단백질의 기능 등으로 대사 과정을 연구하는 것을 'metabolomics' 등으로 분류하나 아직 보편적으로 사용되지는 못하고 있다.

4. 프로테오믹스의 목표

프로테오믹스의 목표를 나열하자면 다음과 같다.
첫째, 프로테오믹스는 기능을 갖는 단백질들의 발현을 종합적이고 정량적으로 측정하는 가장 직접적인 수단이고,
둘째, 생물학적인 동요(perturbation)(질병, 약물투여, shock등) 에 의하여 변하는 단백질들의 발현양상의 변화를 정확하게 관찰 할 수 있으며,
셋째,in vivo 에서 유전자발현의 궁극적인 양상을 규명할 수 있고,
넷째, 유전자, 단백질 및 질병간의 연결고리를 제공한다.

다시 말해서, 프로테오믹스는 유전체 구조와 세포내 행동간에 갭을 메우는 역할을 하는데 게놈의 다이나믹한 단백질 생성물과 그 들간의 상호관계를 연구하는 분야이다.

생명공학 분야에서 이 기술의 발전은 대량발굴탐색(High-throughput screening)이 가능한 2-D 전기영동 분석과 MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption ionization time of flight) 에 의한 자동화된 단백질 분자 구조 분석 기술 및 이 들을 지원하는 생물정보학 (Bioinformatics)의 발전과 연계되어 있다.

따라서, 프로테오믹스는 세포의 생리적 상태변화에 따른 분자적인 현상과 세부적인 기전을 발굴할 뿐만 아니라 어떻게 단백질의 표현형 (phenotype)이 질병과 약물 처리에 따라 변화하는 지를 분석 할 수 있고, 이로 인해 약물표적의 식별과 검증을 할 수 있게 된다.

실제로, 프로테오믹스가 약물표적발굴에서도 가장 강력한 기술인 이유는 다음과 같다.

첫째, 게놈데이타 (DNA/RNA)는 약물표적을 식별하는데 충분한 정보가 되지 못할뿐더러, 단백질만이 실제로 약물의 mode-of action 의 최종 장소이고,

둘째, 유전자 발현에서 보이는 효과들은 단순히 단백질수준에서 내는 약물효과에 대한 반응에 지나지 않으며,

셋째, 유전자 발현과 단백질 발현간에는 직접적인 관련성이 항상 있는 것은 아니기 때문에 유전자와 이것의 기능간의 교량역할을 할 수 있는 단백질의 cur할을 분석하는 것이 중요하며,  

넷째, 단백질-단백질간의 결합이야 말로 세포내 생물학적인 작용의 최종적인 행위가 되기 때문이다.

5. 프로테오믹스의 핵심 기술

1) 단백질 질량분석기술

프로테오믹스의 시작점인 단백질 생화학은 한때 매우 느리고 어려운 일로 여겨져 왔다. 단백질 연구가 유전자 연구보다 매우 느린 이유는 DNA 처럼 대량증폭이 불가능하고 비교적 용액상에서 불안정하여 기능을 쉽게 잃는데다 조직에서의 분리 정제가 매우 어려워 정제된 단백질을 사용하여 연구해야 하는 일 (예, 약리성 호르몬 단백질, 펩타이드성 약물 등)에는 그만큼 적용이 더디었다.

이러한 데에는 단백질 자체가 생합성후의 변형이 매우 다양하여 일률적인 추출, 분리, 정제방법이 적용되기 어려웠기 때문이기도 하다. 한 단백질의 정제에 보통 수년간의 시간이 소요됨은 당연한 이치이다. 일찍이 지금처럼 기술적으로 단백질의 복잡한 정제과정 대신 2-D gel로 분석하여 표적 단백질을 분리하고, MALDI-TOF 과 QTOF 질량분석기로 attomole (10-18) 수준의 극미량의 단백질을 할 수만 있었어도 유전체학분야처럼 매우 발달되어 있었을 것이다.

프로테옴 기술이 보다 널리 활용되고 급속히 변해가는 관련기술을 수용키 위해서는 보다 공통기반적인 기반 기술이 필요하다. 즉, 유전체학 (Genomics)에서 DNA의 증폭기술 (PCR)이 일종의 게놈구조결정의 전환점이 된 것처럼 단백질도 무엇인가 그런 핵심적(Core)이고 기반적인(platform) 기술이 필요했다. 이것이 바로 위에서 언급한 2-D gel을 이용한 분석기술이고, MALDI-Mass 분석기술이라고 본다. 이중에서도 2-D gel 전기영동은 매우 정교한 단백질 분리기술인데도 불구하고 분석용외에는 분리정제용 목적으로 사용되지 않은 탓에 현재의 프로테오믹스 구성분처럼 큰 기능을 못하였다.

단백질의 화학적인 분자량 측정에는 다른 작은 생체분자들처럼 MALDI 와 ESI (분무이온화법)이 있다. MALDI는 2D-gel 상에 분리된 단백질을 trypsin 으로 가수분해하여 얻은 단일전하를 띈 이온화된 펩타이드를 분석하는 기법이다.

ESI 방법은 정제된 시료를 이온화 시켜 (다중전하등) 분석하는 방법으로 LC 등 컬럼크로마토그라피와 연결시켜 사용할 수 있다. 효과적인 MALDI 분석을 위하여는 질소레이저(337 nm)를 사용, 분석대상물질의 비행시간을 측정하여 각각의 mass (m/z)를 분석하는 TOF 형 (MALDI-TOF) 이 활용된다.

 

2) Preparative 2D

프로테오믹스 분야에서 가장 중요한 발전은 2-D gel을 "preparative" 용도로 사용하기 시작한 것으로 여기에다 고정화된 pH gradient 기술이 접목이 되면서 매우 빠르게 프로테오믹스 기술이 진전되기 시작하였다. 이와 더불어 2-D gel용 sample 추출방법과 densitometer에 의한 image 분석이 개발되면서, 이 2-D gel은 매우 빠른 속도로 발전하기 시작하였다.

프로테옴기술의 핵심중 하나는 앞서 언급했듯이 전통적인 단백질 생화학 기술로서 이미 26년전에 사용되기 시작했던 2-D 전기영동 기술이다. 즉, 단백질의 pH 등전점 (pI)으로 나타내는 net charge에 따라 제1차 분석을 한 후 (1D), 이어서 분자량에 따라 분리하는 (2D) 방법이다.

이 기술을 사용하면 분석 대상 단백질 sample을 세포의 특정 생리 조건에 따라 제조하여 특정 spot에 대한 분리 양상을 지도로 구성할 수 있다. 여기서 나타난 연구대상의 특정 spot의 단백질을 적당한 크기로 자르고, 이것들을 trypsin을 사용하여 단편조각들로 만든 후 위에서 언급한 MALDI-TOF등의 단백질 질량 분석기로 분석하여 아미노산 서열을 결정하고, 이를 바탕으로 단백질이나 genome data base를 bioinformatics tool로 찾아 이 단백질의 정체를 확인하는 연속된 과정이다.

이후의 일은 이 단백질의 신규성과 기능을 알게된 cDNA로 찾아 세포내에서 과다 발현시켜 in vitro assay (효소분석)를 하거나 해당 유전자의 knock-out 동물이나 변이 세포를 사용하여 그 유전자의 기능을in vivo에서 검정 (target validation) 한다. 문제는, 이렇게 발견된 단백질의 신규성 (novelty) 여부와 이것의 기능이 얼마나 다양한지를 밝히는 일인 것이다.

 

 6. 프로테오믹스의 분석도구인 데이터베이스

프로테오믹스 연구에 가장 중요한 자원중의 하나는 샘플원 (각종 tissue나 biofluid) 을 2-D gel로 분석한 전형적인 패턴이나 각종 펩타이드의 mass-fingerprinting을 저장하고 이를 기반으로 동 분야 연구진들이 활용할 수 있게 data로 구축하고 활용하는 dBase system이다 (Bairoch, 1997)(표1). 현재public domain에 실려진 dBase는 아직도 구축과정에 있거나 종류나 질적인 면에서 매우 열악한 상태에 있기 때문에 국내에서도 기반을 구축하지 않으면 기존에 다른 연구팀들이 구축한 ExPasy 같은 공용 domain 도 활용할 수 없다.

이러한 dBase는 새로운 유전자를 발굴하는데 가장 유용하게 사용할 수 있는 도구이며 약물표적의 신규성 유무를 판별하는데도 필수적이다. 특히 단백질의 발현 profile을 만들어 임상시험이나 전임상 독성연구에 활용함은 매우 중요하다. 이러한 단백질 발현양상을 특정약물에 대해 얻을 경우 부작용의 예측이나 약리효능 분석, 내성연구 및 내성회피 표적을 발굴할 수 있을 것이다. 현재 website에는 프로테옴분석을 위한 갖가지 정보가 가용하다.

대표적인 것이 SwissProt (www.expasy.ch/)으로 2-D gel 패턴을 샘플 origin 별로 구분하여 구축한 것이다. 그외에도 많은 회사와 대학 그룹에서 proteome 분석용 실험방법과 필요한 2-D gel 패턴을 web에 싣고 있으나 접근이 항상 자유롭지 못한 것이 공통점이다 (표1참조). 국내에는 아직 이러한 site 가 구축되어 있음이 보고된 바 없다.

 

 7. 프로테오믹스와 단백질 칩

단백질칩 (protein chip)은 2-D gel과 함께 프로테오믹스 기술의 중요한 분야로 활용되고 있다. DNA 칩처럼 항체나 항원, 또는 전사인자 및 ion-exchanger, hydrophobic surface를 chip 표면에 고정시켜서 대단위로 스크리닝을 하거나 표적분자인식을 하는데 사용한다. Ciphergen의 SELDI protein chip이 대표적인 것으로, 여기에는 His-tagged 단백질, GST-fusion 단백질 등을 target 단백질로 활용하고 잇다. 이를 이용, 극미량의 샘플에서 이것과 결합할 수 있는 관련 단백질을 분리할 수 있으며 직접 SELDI MS를 이용하여 질량과 아미노산 구조이 가능하다.

단백질칩은 진단뿐 아니라특정단백질의 정제용으로 활용이 가능하다. 실제로 Biacore 같은 기기는 이 단백질 칩기술의 대표적인 성과로서 단백질간, 또는 단백질과 물질들의 결합 kinetics, 정량분석을 가능하게 하는 분석기기이다. 중요한 것은 칩에 붙이는 단백질탐침의 특이성과 안정성이며, 칩 표면에의 coating 기술일 것이다. 이러한 기술개발은 몇몇 벤쳐회사 (예. 다이아칩, 프로테오젠 주식회사등) 를 중심으로 국내에서도 개발이 진행중에 있다.

 

 8. 프로테오믹스의 현재 기술상의 문제점

프로테오믹스는 다양한 적용성과 HTS 방식의 하나임에도 불구하고, 몇가지 해결해야할 기술적인 병목점(bottleneck)을 지니고 있다(그림 2).

첫째로, 샘플원의 분석에 따른 재현성 문제인데, 2 D gel 분석시 샘플추출과 전처리 조건에 따라 패턴이 다양하게 달라지는 것으로서 이러한 것은 같은 조직의 샘플이라도 재현성을 감소시키는 조건이 된다. 각종 샘플원에 대한 표준화된 샘플 전처리(예, 용액화등)와 2D gel 분석조건등의 구축이 요구된다 (Link, A.J., 1999).

둘째로는, 낮은 농도로 존재하는 단백질과 높은 농도로 존재하는 단백질들간에는 2-D gel 상에서 무려 10만-100만 배 이상의 차이가 나는 것으로 알려지고 있다 (예, albumin과 특정 growth hormone). 문제는 희소농도로 존재하는 단백질을 어떻게 효율적으로 발굴해 내는가 하는데 여기에는 많은 핵심기술을 필요로 한다.

가령, 혈청샘플이라면 albumin 이나 IgG를 제거함으로써 희소농도의 단백질이 탐지되게 하는 것이다. 이밖에도, 수식화된 단백질(예, glycosylated, methylated 등) 에 대한 분석법에 장애가 많으며, 2D gel dBase 의 구축이 미흡한 데다, 자동화기술등에 아직 개발의 여지가 많다.

 

9. 프로테오믹스의 이용

1) Differential Display 패턴 분석  프로테오믹스의 주요 적용대상 중 하나는 각 샘플 (세포, 조직, 체액 등)을 처리시 그때마다 다양한 표현형의 차이(differental display)가 나오는 것을 패턴분석을 통하여 비교할 수 있는 수단을 제공하는 것이다. 그러한 차이로 어떻게 빨리, 집중적으로 발굴하여 생물학적 의미를 부여하는 것이 연구자가 할 일이다. 가령 간암조직을 환자로부터 얻었다고 했을 때, 같은 부위의 정상조직을 비교하면 우리가 촛점을 두고자 하는 단백질에 따라 많은 표현형의 차이를 탐지할 수 있고, 차이점이 어디에 있는지를 암의 전이단계 별로 식별해 낼 수 만 있다면 암전이관련 표적 단백질이 발견되는 셈이다.

이 단백질을 찾아가는데에는 2-D gel image 분석 software가 Melanie III (BioRad 사 2000년도 시판)나 PDQuest 프로그램을 사용하여 지금까지 발견된 다른 단백질과의 차이점 (modification)을 제시하므로 이것의 변화양상을 알 수 있고, 이것과 암전이, 암 발생간의 상관성을 규명할 수 있다. 데이터의 신뢰성을 부여하려면, 보다 다양한 조건, 특히 좁은범위의 pH (예, single pH 5.5-6.5)에서 구분하여 image 분석을 하면 매우 좋은 differental display 패턴을 얻을 수 있을 것이다.


2) Quantitative Proteomics

이 기술은 세포의 상태별 (cell state 1, 2)로 특정단백질의 분포와 농도차이 변화를 동위원소로 in vivo에서 표지하여 표지된 것과 대조군간의 차이를 MALDI-MASS 로 분석하는 기술이다 (Mann, 1999). 이 방법으로 한 유전자로부터 만들어 지는 유사한 단백질류를 효과적을 정량할 수 있으며 yeast 와 박테리아등의 배양시 튿정단백질을 tagging 하면 성장조건에 따른 분포변화를 정량할 수 있다.


3) Post-translational modification 규명

유전체학(Genomics)와 proteomics 간 가장 큰 차이점이 바로 단백질만이 갖는 변형패턴 (phosphorylation, glycosylation, methylation, farnesylation 등)일 것이다. 특히 단백질의 이러한 modification이 실질적으로 그 단백질의 중요한 기능을 결정짓는 요인이므로 이것에 근거한 단백질의 식별과 특성연구를 할 수 있는 것은 proteomics 만이 갖는 핵심기술이 되는 것이다. 이러한 변형은 세포의 주기별로, 병적인 상태나 외부균에 의한 전염상태 등에 의해 다양하게 일어나므로 프로테오믹스가 이러한 것을 분석해낸다는 것은 매우 중요한 의미를 가진다.


4) Protein-Protein interactions  

프로테오믹스를 활용하면 세포내 각종 단백질 들간의 결합이나 상호관계를 파악하는데 중요한 정보를 얻을 수 있다. 예를 들면 G-protein 관련 신호전달 과정에서 각 단백질들이 일련의 oligomerization을 하거나, 그들간의 non-covalent 결합을 2-D gel (native gel)로 분석하면, yeast two-hybrid system이나 western blotting에 비해 간편하게 단백질간의 관계를 파악 할 수 있다 (Godovac-Zimmermann et al., 1999). 실제로 약 2% 정도의 질병만이 단일 유전자에 의한 결합으로 알려지고 대부분은 단백질과 복합유전자들의 장애로 인한 질병이라고 알려져 있다. 특히 인산화된 단백질이 원인이라면, anti-phosphotyrosine이나 anti-phosphoserine 항체를 사용하여 인산화된 단백질을 2-D gel상에서 blotting 한 후 western blotting으로 찾아 낼 수 있을 것이다. 세포내 네트웍을 규명할 수 있으므로 이를 "Functional Proteomics'라고 부르기도 한다.


5) Fuctional Proteomics  

프로테오믹스를 분야별로 크게 structural proteomics 와 functional proteomics 로 나누기도 한다. 이중 Functional proteomics는 연구목적에 따라 다시 'expression proteomics'와 'cell map proteomics'로 구분하는 경향이 있다 (Blackstock & Weir 1999). 가령, 특정조건하에서 얻은 한 세포나 조직에서 EST 지도처럼 발현된 단백질들의 정량적인 지도를 들 수 있으며, 이것을 통해 이러한 시도는 한 단백질의 경로가 질병이나 약물 또는 생리적인 자극에 의해 어떠한 형태로 변형되는 가를 연구할 수 있게 한다.

이것을 'expression proteomis' 라고 정의한다 (Blackstock & Weir, 1999). 이 기술은 낮은 copy 수로 존재하는 단백질에 대한 표지기술을 활용하여 질병 marker를 발견할 수 있고, 독성과 약물작용연구도 쉬워진다. 문제는 세포내 경로별 단백질들의 정확한 측정이 관건이다.

이에 반해 'cell map proteomics' 는 체계적으로 단백질 복합체와 이들간의 결합을 분석하여 물리적 지도를 만들어 각각의 기능을 밝히고 상대적인 관계를 규명하는 일이다. 실제에 있어서는 이들을 모두 활용하여야만 완전한 단백질의 패턴 분석과 신규성 판단은 물론 표적단백질의 생리적 기능을 분석할 수 있을 것이다.

cell map 작성으로 세포내 신호전달과정의 규명과 약물표적의 식별과 검증이 가능하며 이러한 cell map 이 작성된 소위"virtual cell" 은 질병의 발병기전실험이나 약물투여 전후의 생리적 변화를 세밀하게 관찰할 수 있어서 21C 의 세포분자생물학연구의 중요 도구가 될 것이다.

10. 인체질병원인단백질의 탐색과 의학에의 응용

1) 프로테오믹스를 이용한 암연구의 예

대부분 질환은 그 원인이 매우 복잡하고, 유전적 결함 뿐 아니라 대사조절의 문제와 복합적으로 얽혀 있다. 암은 발생하는 조직에 따라 뇌, 유방, 폐, 대장, 신장, 난소 및 전립선등으로 유별되며 암 발생의 각 조직을 이용, 프로테옴분석을 할 수 있다. 하나의 예를 논문에 보고된 결장직장암의 경우로 들어 본다. 이 암은 여러 유전자들의 돌연변이로 인해 tumor suppressor gene 들의 기능상실과 oncogene들의 활성이 관여하여 일어나는 복합단계를 거쳐 생기는데, 아직까지 그 기전은 명확하지 않다.

최근 Jungblut 등 (1999)에 의해 암조직의 일부를 2-D 분석을 통해 암의 진전에 따라 발현이 증가되는 13/5,6 단백질을 식별하였고, 이것이 calgranulin B (calprotectin)임을 밝혀낸바 있다. 암 전이에서 이것의 구체적인 역할이 무엇인지는 현재 연구가 진행중이다. 이와 관련 하여 현재까지 Myers 등 (1997)은 60 여개의 암 세포주에 대하여 2D PAGE dBase를 개발 한 바 있으며, 이들 단백질 spot 과 4000 여개의 약물간의 관계를 설정 한 바 있다.


2) 프로테오믹스를 이용한 감염성 질환 연구사례  

1996년도 세계 전체사망인구중 감염성질환으로 사망하는 비율이 42%에 달하고 있다(1997 WHO 보고서). 가령, 결핵 (Tuberculosis: TB)만 하더라도, 매년 8백만명의 새로운 환자를 만들고, 전 세계 인구의 1/3이 잠재적 보균자로 알려져 있으나 아직까지 정확하고 신뢰할 수 있는 진단법이나 biomarker 가 발견되지 않고 있는 실정이다 (WHO 1999 보고서).

프로테오믹스를 사용하여, 최근에는 TB의 주요 원인인 mycobacterium의 2D map 분석과 이들 균주들에 대한 proteome 연구용 dBase가 구축되었다 (Mollenkopf et al., 1999). 이러한 전염성 균주들을 내성과 비내성 등으로 구분하여 각각의 proteome 분석을 실시한 결과 700여종의 특정 단백질들의 존재가 확인되었고, 이들 중 일부는 TB의 진단과 치료에 중요한 단서가 될 것으로 기대된다.


3) 프로테오믹스를 이용한 항비만관련연구

Edvardsson 등 (1999)은 obese mice 들의 PPAR (peroxisome proliferation activator regulator) 전사인자들의 isoform에 대한 proteome 분석을 항비만 약물 (예, WY14,643) 투여 전후를 통해 실시하여, 최소한 16개 spot의 단백질 군이 발현증가 됨을 확인하였다. 이들중 14개 spots들이 peroxisomal fatty acid 대사에 관여하는 단백질임을 확인한 바 있으며, 이로 인해 이 항 비만제의 작용기전이 peroxisome에서 지방산 산화 (b-oxidation)를 촉진함을 규명하기도 하였다.


4) 프로테오믹스를 이용한 생식기전 연구

중요한 생식작용에 관여하는 조직 (testis, ovary, placenta, endometriu, oviduct) 들을 분자수준에서 조사하고, 특히 reproductive toxicans의 효과나, 질환 상태 등에서 호르몬이나 cytokine의 효과를 관찰하여 이들 과정에 어떻게 관여하는 지를 규명할 수 있다.

특히 자궁내착상 부전이나 유산 등을 일으키는 원인단백질을 조사할 수 있을 것이다 (Shetty et al., 1999). 특히, Center for Reconstruct Gamete Contraceptive Vaccinogen에서는 1400개의 단백질 군을 갖는 인간의 spermatozoa를 proteome 분석을 통해 구축한 바 있으며 (Naaby-Hansen et al., 1997), 이를 이용, 불임 남녀들의 serum의 antiserum antibodies에 의해 인식되는 단백질이 어떤 것인가를 확인할 수 있었고, 이들의 억제를 연구하게 되면 불임치료를 가능하게 할 수 있는 근거가 마련될 것으로 기대된다 (Brewis, 1999).


 5) 약물독성 연구분야 2D PAGE를 이용하여 단백질 발현의 정량적인 분석으로 약물(예, peroxisome prolirerator, retinoic acid) 의 영향과 세포에 대한 독성을 연구할 수 있다. 특히 티이레놀과 같은 진통제성분으로 씌이는 acetaminophen 의 간독성이나 (Myers et al., 1995), poly-lactic acid 의 임파세포 독성 및 페니실린과 알부민과의 결합등(Marzocchi et al., 1995)이 보고된 바 있다. 이 밖에도 src SH domain 과 결합하는 저해제를 연구하고, 네오마이신의 aminoglycoside 와 HIV Tat 펩타이드-TAR RNA 간의 결합도 프로테오믹스로 분석하는 기법이 보고된 바 있다.

 11. 프로테오믹스의 향후 발전방향

1). 단백질의 전처리 기술

2-DE의 가장 중요한 전제조건이 단백질 샘플의 전처리 과정으로 비 단백질 성분과의 효과적인 분리와 용액화 (solubilization)일 것이다. 특히, 세포벽의 단백질이나 지질막 결합된 단백질 (효소, receptor 등)은 전처리가 효과적이지 못할 경우 정확한 프로테옴 분석이 불가능하다 (Berbert, 1999).

가장 보편적인 IEF 전기영동용 샘플용액은 8M Urea, 4% CHAPS, 50-100mM DTT 및 Tris 이다. 그러나, 막결합 단백질의 경우 갖가지 세밀한 조건이 단백질별로 필요하며, 여기에는 chaotropic agent (Urea), surfactant (SDS, Triton X-100, b-octylglucoside 등), reducing agent (DTT, Tributyl phosphate 등)가 쓰이고, 요즘에는 SB3-10, ASB14와 같은 surfactant를 사용한다.

이들 단백질 전처리 방법과 단계적인 추출법을 적용하면, 보다 효과적으로 1D 분석용 단백질을 얻을수 있다. 소수성의 막결합 단백질의 경우, 우선 1차로 세포를 분해 (lysis)시키고, 이것을 IEF solution으로 처리한 후 상기한 detergent를 단계별로 사용하여 용액화를 높임으로써 2DE 분석에 되도록 많은 spot을 탐지할 수 있게 할 수 있다.


2) Laser Capture Microdisection (LCM)의 이용

최근에 NIH에서 개발되어 상용화된 infra-red laser capture disection (LCM) 기술은 매우 선택적으로 신속하게 tissue의 특정지역을 미세절단 해낼 수 있다 (ref. Eanks et al., 1999). 이렇게 절단된 조직을 사용 프로테오믹스에 적용할 경우 특정 세포와 특정 지역에 대한 (예, solid tumor) cell map을 작성할 수 있으며, 이들의 변형유무를 판별하여 질환의 관련 여부를 규명할 수 있을 것으로 기대된다.


3) 프로테오믹스의 자동화

프로테오믹스의 지향목표는 대량발굴의 HTS 이므로, 고도의 재현성과 신뢰성을 이루려면 자동화, 단순호, 표준화가 이루어져야 한다 (Quadroni & James, 1999). 이들을 위해 샘플 전처리부터 protein의 mass fingerprinting 분석까지 전 system이 자동화되어야 하는데 이에 대한 연구가 스위스, 영국, 호주, 덴마크 중심으로 진행되고 있다.

자동화분야 대상으로는 시료 전처리 과정, 2-DE 과정, Spot-selection과 protein digestion MALDI-Mass분석 DATA analysis 및 평가등이다. 특히 이들 선진국에서는 (예, Glaxo Wellcome Co.) 각각의 과정을 자동화 로봇으로 이루어 지도록 개발을 추진중에 있다.

그러나, 중요한 bottleneck으로는 각 단계별로 2-DE의 automation과 단백질 탐지, staining, trypsin digestion, 그리고 Mass 분석 등으로, 각 단계별로 해결해야할 문제들이 많다 (Fig. 2).

지금까지 이룬 자동화된 프로테오믹스에 대한 부분적인 성과로는 미국의 Large Scale Biology에서 Iso-Dalt 포맷으로 일주일에 100장의 gel을 수행할 수 있는 기기를 만들어 보고한 바 있다. Proteome Inc. 역시, proteomation이라는 기기로 대형 gel (40x40cm)을 만들고, running 하고 staining까지 수작업을 거치지 않고 할 수 있도록 자동화 시켰다는 보고가 있다. 단백질의 탐지도 방사능 동위원소로 표지된 분자로 MPD (multiploto detection) imager로서 10-22 molecules의 탐지가 가능하게 되었다.

2-D PAGE에서 직접 얻은 단백질의 질량분석방법을 현재 APAF을 비롯한 여러 연구팀에서 연구중에 있으며, 특히 intact한 단백질의 질량 분석을 infrared laser (위 참조)로 PVDF blot에 부착된 특정 단백질을 이온화하는 기술도 개발중이다. 특히 1차 전기영동한 IPG strip으로부터 직접 단백질을 UV laser로 desorption 시킬 수 있는 기술은 향후 2-D PAGE의 대체기술로 부각되고 있다.

프로테오믹스의 Nanotechnology 도입은 매우 중요한 발전분야중 하나이다. 즉, 2-D PAGE를 대체할 수 있는 기술로서, Capillary-zone electrophoresis (CZE), (Despeyroux et al., 2000)를 단백질의 소수성(hydrophobicity)에 근거한 분리법과 융합시키는 것이다. 이 밖에도 단백질 chip 기술은 지금 매우 많은 진전을 보이고 있다. 이는 각종 진단용 antigen이나 ligand 들을 칩에 coating 하는 기술이 국내에서도 활발하게 연구되고 있다.

 

 12. 국내 프로테오믹스 연구의 활성화

1) 현황

국내에도 프로테오믹스에 대한 관심도가 매우 높아 일부 국책과제(과기부의 21C 프론테어사업등)와 산학협동연구를 통하여 시범적으로 진행중에 있다. 2D gel 분석부터 MALDI-TOF 및 Image 분석 시설이 어느정도 갖추어진 곳은 연세대학교의 프로테옴연구센터를 비롯하여 기초과학지원 센터등 전국적으로 2-3 군데 정도이며, 산업자원부에서도 국책 프로테오믹스 센터의 설립을 기획 하고 있는 것으로 알고 있다. 이미 미국과 일본은 정부와 기업체가 합동으로 "프로테오믹스센터"를 설립하거나 설립중에 있으며 일찍이 국내에서도 올해중 시작 할 경우 4년전에 시작한 호주의 APAF 등에 비하면 그리 늦은 편은 아니다.


2) 국내 프로테오믹스연구의 활성화

국내에서는 프로테옴중점연구회 (회장 김유삼 연세대교수)가 과학재단의 지원으로 99년 9월에 설립되어 활동중이다. 이 연구회를 중심으로 본격적인 프로테오믹스를 확산시켜 각 분야에서 이를 적극 활용할 경우 핵심기술은 물론 여러 가지 기초생물, 생화학, 의학, 약학분야에서 그 적용도는 매우 클 것이며 인체게놈연구 분야에서 전혀 아무런 공헌도 못한 우리의 위치를 다소나마 회복할 수 잇는 절호의 기회가 될 것이다. 정부나 민간 모두 집중 투자해야할 대상이 이 프로테오믹스 분야가 틀림없다고 믿는다. 과기부의 국책과제인 '21C 프론티어 사업'에서도 보다 비중있게 기반기술의 구축과 과제지원이 이루어 져야 할 것이다.

 

Fig. 1. 프로테오믹스의 응용분야   

 

 

Fig. 2. 프로테오믹스의 주요 Bottleneck

 

Fig. 3. 국내 프로테오믹스활성화방안

 

## References

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